Proses Crynodiad Ultrafiltration/Dafiltration i lawr yr afon: Sut i Atal Treiddiad a Cholled Protein Targed yn Effeithiol

Proses crynodiad uwch-hidlo/dafiltiad i lawr yr afon: Sut i atal treiddiad a cholled protein targed yn effeithiol

Mewn prosesau puro i lawr yr afon ar gyfer proteinau ailgyfunol, cynhyrchion gwaed, a biolegau eraill, defnyddir uwch-hidlo/dafiltration (UF/DF) ar gyfer crynhoi porthiant, cyfnewid byffer, a thynnu halwynau ac amhureddau moleciwlaidd bach. Cyflawnir gwahaniad yn seiliedig ar hidlo pilen: mae moleciwlau mawr fel gwrthgyrff monoclonaidd (mAbs) yn cael eu cadw gan y bilen, tra bod halwynau, endotocsinau, proteinau celloedd cynnal rhydd (HCPs), ac amhureddau moleciwlaidd bach eraill yn mynd trwy'r bilen ac yn cael eu tynnu yn y treiddiad. Yn ystod graddfa'r broses-i fyny, gall colli protein targed drwy'r bilen ddigwydd yn rhwydd, gan leihau'r cynnyrch yn uniongyrchol a chynyddu costau swp. Mewn rhai amodau gweithredu, mae'n bosibl y bydd protein yn cael ei ganfod yn y treiddiad, sy'n gofyn am benderfynu'n gyflym a yw'r cydrannau a ollyngwyd yn mAb targed cyflawn, agregau diraddedig/tameidiog, neu broteinau celloedd cynnal. Mae'r erthygl hon wedi'i rhannu'n ddwy brif ran: mae'n adolygu dulliau rheoli prosesau traddodiadol ac, ar y cyd â Dylunio Arbrofion (DOE), yn sefydlu ffenestr broses gadarn, wedi'i hategu gan ddulliau dadansoddi lluosog i bennu hunaniaeth y proteinau a ganfyddir yn y treiddiad.

 

 

I. Achosion Allweddol Treiddiad Protein Targed Trwy'r Pilen Yn ystod UF/DF

1. Pwysedd trawsbilen gormodol (TMP)
Pan fydd y gwahaniaeth pwysau ar draws y bilen yn rhy uchel, mae llusgo toddyddion yn cael ei wella, gan orfodi rhywfaint o brotein monomerig i mewn i'r treiddiad. Yn ystod y raddfa-i fyny, mae'r tanc bwydo'n cynnwys cyfaint mwy o ddeunydd ac mae amrywiadau gwasgedd yn y pibellau yn fwy amlwg, sy'n golygu bod gorbwysedd dros dro yn fwy tebygol nag ar raddfa labordy.

2. Cyfradd llif tangential amhriodol
Os yw'r gyfradd llif yn rhy isel, mae haen polareiddio crynodiad trwchus yn ffurfio ar wyneb y bilen, a gall y crynodiad protein lleol fod yn uwch na throthwy goddefgarwch y bilen. Os yw'r gyfradd llif yn rhy uchel, gall straen cneifio achosi holltiad strwythurol y mAb, gan gynhyrchu darnau llai o brotein a all basio'n rhydd trwy'r mandyllau pilen.

3. Crynodiad protein rhy uchel yn y porthiant
Pan fo'r crynodiad protein yn y bwyd anifeiliaid yn rhy uchel, mae protein yn cronni ar wyneb y bilen, a gellir cario rhywfaint o brotein monomerig i'r treiddiad. Mae hwn yn broblem gyffredin mewn cynhyrchu ar raddfa fawr.

4. pH neu dargludedd y tu allan i'r ystod broses
Gall newidiadau yn nodweddion gwefr y protein leihau ei radiws hydradu a maint y gronynnau ymddangosiadol, gan arwain at dreiddiad pilen annormal.

5. Heneiddio casét bilen, fflwcs tryledol uchel, neu gyn-gyflyru annigonol
Gall diffygion corfforol yn y casét bilen achosi gollyngiadau protein yn uniongyrchol a chynrychioli risg sy'n gysylltiedig ag offer. Gall CIP dro ar ôl tro gyda datrysiadau alcalïaidd cryf niweidio deunydd bilen polyethersulfone (PES) yn raddol.

6. Cyfaint diafiltrau gormodol
Yn ystod diahidlo hirfaith, gall fflysio toddyddion parhaus gario symiau bach o brotein monomerig i ffwrdd yn raddol.

 

II. Mesurau Ymarferol Traddodiadol i Atal Treiddiad a Cholled Protein Targed

(A) Rheoli Paramedr Proses

1. Rheoli pwysedd trawsbilen (TMP)
Diffiniwch derfyn rhybudd pwysedd uchaf a gosodwch larymau cyd-gloi i atal effeithiau pwysedd uchel dros dro ar haen y bilen. Ar ôl pennu paramedrau gwaelodlin ar raddfa fach, lleihau'r pwysau gweithredu diogel yn ystod y raddfa-cynhyrchu a chadw ystod goddefiant proses briodol.

2. Optimeiddio'r gyfradd trawslif
Sefydlu haen ffin sefydlog a lleihau polareiddio crynodiad ar wyneb y bilen trwy groeslif, a thrwy hynny leihau cronni protein ar wyneb y bilen yn y ffynhonnell.

3. Cyfyngu ar y crynodiad terfynol ar ôl canolbwyntio
Diffinio terfyn crynodiad yn seiliedig ar briodweddau ffisiogemegol y protein ac osgoi crynodiad gormodol o borthiant. Ar gyfer mAbs, nid yw'r crynodiad terfynol arferol yn gyffredinol yn fwy na 50 mg / mL; ar gyfer rhywfaint o agregu-mAbs tueddol, dylid lleihau'r crynodiad ymhellach.

4. Rheoli pH porthiant a dargludedd
Cynnal maint gronynnau hydradol sefydlog o'r protein ac osgoi cyfangiad moleciwlaidd a achosir gan aflonyddwch cryfder asid/bas neu ïonig.

(B) Offer a Rheolaethau Gweithredu

1. Perfformio profion cywirdeb casét bilen cyn pob swp
Cynhaliwch brawf pwynt swigen cyn cynhyrchu pob swp i adnabod ffibrau pilen sydd wedi torri. Dylid taflu casetiau pilen sydd wedi'u difrodi ar unwaith i atal gollyngiadau protein parhaus.

2. Safoni'r weithdrefn glanhau CIP
Rheoli'r crynodiad NaOH a'r amser cyswllt. Ar ôl glanhau alcalïaidd cryf, cydbwyswch y deunydd bilen yn llawn i leihau'r risg o anffurfiad mandwll bilen.

3. Defnyddio diahidlo fesul cam
Defnyddiwch gyfnewidiad byffer cyfaint mawr yn ystod y cyfnod cynnar i gael gwared ar halwynau, ac arafu'r gyfradd llif diahidlo wrth i'r pwynt terfyn nesáu i leihau llusgo a cholli protein.

 

III. Sefydlu Gofod Dylunio Proses Trwy DOE (Nodweddu Proses QbD; Yn berthnasol i Gyflwyno IND)

1. Sgrinio ffactor
Sgrinio pum paramedrau proses UF/DF allweddol (P): pwysedd trawsbilen, cyfradd llif porthiant, crynodiad protein cychwynnol, pH porthiant, a thymheredd gweithredu.
Newidynnau ymateb: cynnyrch a gedwir, cynnwys protein yn y treiddiad, fflwcs pilen, a chanran o agregau pwysau moleciwlaidd uchel.

Trwy ddadansoddi arwyddocâd, nodwch y ffactorau allweddol sy'n cyfrannu at ollyngiad protein.

2. ymateb modelu wyneb
Dewiswch y pedwar paramedrau sydd â'r arwyddocâd mwyaf i adeiladu arwyneb ymateb a dadansoddi rhyngweithiadau ymhlith paramedrau. O dan lawer o amodau gweithredu, gall un paramedr aros o fewn ei ystod gymwysedig, tra gall y cyfuniad o ddau baramedr arwain at dreiddiad protein. Ni ellir adnabod effeithiau rhyngweithio o'r fath trwy -ffactor-traddodiadol ar-arbrofion amser. Yn seiliedig ar y model, diffiniwch ofod dylunio gweithredol. Cyn belled â bod paramedrau'r broses yn aros o fewn yr ystod hon, gellir sicrhau bod protein yn cael ei gadw'n effeithiol tra bod amhureddau'n cael eu tynnu trwy ddihidlo.

3. Her yr achos gwaethaf (sy'n ofynnol ar gyfer nodweddu proses)
Dewiswch baramedrau proses ar eithafion y ffiniau gweithredu i efelychu amrywioldeb gweithgynhyrchu: TMP uchaf, isafswm cyfradd trawslif, a chrynodiad protein terfyn uchaf. Gwiriwch, hyd yn oed o dan amodau gweithredu eithafol, nad yw -colli protein targed ar raddfa fawr yn digwydd, a thrwy hynny yn bodloni gofynion adolygu CRhH.

 

IV. Dulliau Dadansoddol Lluosog i Adnabod Proteinau a Ganfyddir yn y Treiddiad a Gwahaniaethu mAb Targed, Darnau Diraddio, a HCP

Yn seiliedig ar effeithlonrwydd dadansoddol, cost, a senarios cyflwyno rheoliadol, gellir rhannu'r dulliau yn ddau gategori: sgrinio cyflym a phrofion cadarnhau. Dylid blaenoriaethu dulliau cyflym ar gyfer monitro prosesau arferol; pan fydd gwyriadau annormal yn digwydd, dylid defnyddio dulliau adnabod manwl gywir.

1. Sbectroffotometreg UV (sgrinio cyflym ar-lein; mae'n well gennych fonitro'r llawr mewn siop)
Casglwch y treiddiad a mesurwch ei amsugnedd A280. Gall hyn ond penderfynu a yw protein yn bresennol yn y treiddiad ac ni all wahaniaethu rhwng y rhywogaeth protein. Fe'i defnyddir yn bennaf ar gyfer monitro prosesau arferol. Mae gwerth A280 sy'n cynyddu'n barhaus yn nodi bod gollyngiadau protein yn gwaethygu ac mae angen atal y diahidlo ar unwaith ac ymchwilio i'r broses.

2. SDS-PAGE electrophoresis (dull adnabod ansoddol a ddefnyddir amlaf)
Defnyddiwch electrofforesis rhydwytho a heb ei leihau a chymharwch safleoedd y bandiau â safleoedd y mAb targed yn y porthiant:
1) Os yw safle'r band yn gwbl gyson â'r targed mAb, mae mAb cyfan wedi treiddio i'r bilen.
2) Os bydd bandiau pwysau moleciwlaidd is yn ymddangos, mae'r protein wedi mynd trwy holltiad hydrolytig, gan gynhyrchu darnau mAb.
3) Os yw'r bandiau wedi'u gwasgaru gyda bandiau amrywiol lluosog, mae'r rhan fwyaf yn broteinau celloedd lletyol (HCPs) o gelloedd gwesteiwr E. coli/CHO yn hytrach na'r cynnyrch targed.

3.-maint perfformiad-cromatograffaeth gwahardd (HPSEC) uchel
Gwahanwch gydrannau yn ôl maint moleciwlaidd a chymharwch eu hamseroedd dadelfennu â rhai'r cromatogram porthiant:
- Mae prif uchafbwynt gyda'r un amser cadw â'r mAb yn dynodi protein targed cyflawn.
- Mae eluting brig yn gynharach yn dynodi agregau/darnau pwysau moleciwlaidd uchel.
- Mae eluting brig yn ddiweddarach yn dynodi darnau diraddio pwysau moleciwlaidd isel.
- Mae absenoldeb prif frig nodweddiadol yn dynodi proteinau amhuredd HCP.
Gall y dull hwn ddarparu data meintiol a gellir ei gynnwys mewn adroddiadau ymchwiliad i wyriad prosesau; mae ganddo dderbyniad uchel mewn deunyddiau cyflwyno clinigol.

4. Profion pecyn ELISA protein celloedd HCP
Os canfyddir protein yn y treiddiad, mae canlyniad ELISA yn uwch, ac nid yw HPSEC yn dangos unrhyw frig mAb nodweddiadol, yn y bôn gellir pennu mai'r deunydd sy'n gollwng yw proteinau celloedd CHO host. Mae hyn yn dynodi bod amhuredd yn cael ei ddileu yn ystod puro i fyny'r afon; mae'r amhureddau'n cael eu golchi allan yn ystod y cam UF/DF ac nid ydynt yn cynrychioli colled cynnyrch.

5. Gwirio cromatograffaeth affinedd (cromatograffeg Protein A)
Mae Protein A yn rhwymo rhanbarth Fc o mAbs yn benodol. Llwythwch y sampl treiddiad ar y golofn: mae ymddangosiad brig elution nodweddiadol yn dangos presenoldeb gwrthgorff targed cyfan; mae absenoldeb brig elution yn dangos bod y proteinau yn y treiddiad i gyd yn broteinau amhuredd.

6. Sbectrometreg màs (LC-MS) (olrheiniadwyedd manwl-; a ddefnyddir ar gyfer ymchwilio i wyriadau proses mawr)
Gall LC{0}}MS ddadansoddi'r dilyniant asid amino yn uniongyrchol a phennu tarddiad y protein yn gywir. Fe'i defnyddir yn bennaf ar gyfer ymchwilio i wyriadau anodd neu anarferol ac nid yw'n cael ei ddefnyddio fel rhan o'r drefn mewn-prawf rheoli prosesau.

V. Camau Cywiro Sy'n Cyfateb i Ganlyniadau Dadansoddol Gwahanol

1. mAb targed cyflawn a ganfuwyd yn y treiddiad
Lleihau pwysedd trawsbilen a'r crynodiad terfynol ar ôl canolbwyntio; culhau ystod gweithredu'r broses yn seiliedig ar ganlyniadau DOE; a gwirio cywirdeb casét pilen.

2. Darnau diraddio gwrthgyrff a ganfuwyd yn y treiddiad
Ymchwilio i straen cneifio trwy gydol y broses ac eithafion pH; gwneud y gorau o'r cam anactifadu firaol i fyny'r afon i leihau holltiad protein.

3. Dim ond proteinau amhuredd HCP a ganfyddir yn y treiddiad
Nid oes angen addasu paramedrau UF/DF. Olrhain y mater yn ôl i'r camau cromatograffaeth blaenorol a gwella'r broses o ddileu amhuredd yn ystod-cyfnewid cromatograffaeth affinedd a ïon.

 

VI. Crynodeb

Er mwyn atal protein rhag gollwng yn ystod UF/DF, mae rheoli prosesau traddodiadol yn dibynnu ar brofiad hanesyddol i ddiffinio paramedrau pwyntiau unigol, a all fynd i'r afael yn ddigonol â chynhyrchiant sefydlog ar raddfa fach yn unig. Er mwyn sicrhau perfformiad sefydlog yn ystod graddfa broses fesul cam-i fyny, dylid defnyddio nodweddu proses seiliedig ar DOE i sefydlu gofod dylunio proses gyda goddefgarwch digonol. Gall rheolaeth paramedr seiliedig ar egwyl wneud iawn am amrywioldeb gweithgynhyrchu. Unwaith y bydd protein yn cael ei ganfod yn y treiddiad, gall system synhwyro UV syml roi rhybudd cychwynnol, ac yna electrofforesis, HPSEC, ac ELISA ar gyfer olrhain ac adnabod. Mae hyn yn caniatáu gwahaniaethu cywir rhwng y cynnyrch targed a'r gwesteiwr-amhureddau celloedd, gan alluogi ymchwiliad achos gwreiddiau wedi'i dargedu a chamau cywiro. Mae hon hefyd yn gydran ymchwil safonol sydd wedi'i chynnwys ar hyn o bryd yn nogfennaeth CMC ar gyfer prosiectau mAb.